Descripció

Un citómetre de flux té tres sistemes principals:

Sistema hidràulic
Esta compost d'una sèrie de components fluídics i mecànics necessaris per establir un flux laminar que permeti a la suspensió cel.lular travessar la càmera de flux d'una forma estable i individual.

Sistema òptic
Consta de làser, filtres i lents.
La font de llum és generalment produïda per un o més làser. A la majoria dels citómetres s'instal.la un làser de gas (generalment d'argó) refrigerat per aire, que produeix una llum monocromàtica de 488 nm com a làser principal. Aquesta llum és utilitzada per excitar la majoria de fluorocroms i provoca la dispersió de llum que ens informa de les característiques cel.lulars. Les darreres tecnologies han desenvolupat làsers d'estat sòlid que estan reemplaçant als làsers de gas degut al seu menor consum i major temps d'ús. La presència de més d'un làser ens permetrà ampliar el ventall de lectura de fluorocroms, des de el violeta fins al vermell llunyà. La llum dispera i la fluorescencia serà recogida per un sistema de filtres i miralls que dirigiràn les senyals fins als sensors (fotodiode/fotomultiplicadors).

Sistema electrònic-informàtic
Els fotomultiplicadors converteixen la llum dispersa (fotons) en senyals elèctriques (voltatge). Aquestas senyals analògiques, després de processos de amplificació i conversió, seràn digitalitzades per la posterior visualització a l'ordinador. Actualment, existeixen nous sistemes de conversió a valors digitals que permeten modificar els valors de compensació de senyals fluorescents i escales lin-log posteriorment a l'adquisició de dades.

La perfecta integració d'aquests sistemes permet un ràpid i precís anàlisi d'un elevat nombre de cèl.lules en un curt espai de temps.

Proces

La suspensió cel.lular es previament incubada amb anticossos monoclonals conjugats amb diversos fluorocroms (FITC, PE, PerCP, PECy5, APC, etc.) o sondes fluorescents (PI, DHR, DiOC,...) i és introduida al sistema hidràulic de manera que les cèl.lules travessin la càmera de flux individualment, on el feix de llum del làser les impacta. El contacte del feix del làser amb les cèl.lules produeix dos tipus de dispersió: frontal i lateral (90º). La dispersió frontal (Forward  Scatter) ens dóna informació sobre el tamany cel.lular, mentre que la dispersió lateral (Side Scatter) ens informa de la complexitat cel.lular. Els fluorocroms dels anticossos monoclonals o sondes fluorescents presents a la superfície o l'interior cel.lular són excitats pel làser i generen fluorescències que són recollides pel sistema òptic per el seu posterior processament i digitalització.

Aplicacions

Detecció de subpoblacions cel.lulars (immunofenotipatge)
Apoptosi
Cicle cel.lular
Viabilitat
Assaigs funcionals (metabolisme oxidatiu, proliferació, calci intrace.llular, pH,...)
Separació cel.lular
Assaigs multiplexats (Beads Arrays)

Montatge realitzat a partir de videos de BDBiociencias.
Clicar per visualitzar-lo.

Introducció

La citometria de flux és una metodologia que permet obtenir dades sobre les característiques físiques i químiques de cèl.lules o partícules en suspensió que travessen una font de llum (làser) . Les aplicacions són molt variades, des del diagnòstic clínic (principalment a l'Hematologia oncològica i la Immunologia), fins a complexos projectes de recerca al camp de la biomedicina i la biologia cel.lular general.

Desprès d'uns intents inicials sense éxit per a realitzar un contatge cel.lullar automatitzat als principis del segle XX, als anys 50 es va començar a desenvolupar una tecnologia per mesurar bacteris durant l'època de la guerra freda per fer front a la guerra bacteriològica. El perfeccionament de la cambra de flux als anys vinents (60's) va permetre les primeres aplicacions amb citòmetres experimentals, fins que van aparéixer als anys 70 els primers equips produïts en sèrie. Paralelament, amb el mateixos principis, es va desarrollar la tecnologia de la separació cel.lular per deflecció electrostàtica, un híbrid entre un citòmetre de flux i una impresora d'injecció de tinta. D'aquest últim, ve l'acrònim FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).

El desenvolupament dels anticossos monoclonals als anys 80, junt amb el perfeccionament dels citómetres de flux, ha permès l'ús de la citometria de flux en el diagnòstic clínic, des de l'estudi de subpoblacions limfocitàries CD4+ per monitoritzar l'evolució de l'VIH, passant pel diagnòstic de patologies hemàtològiques i l'estudi del cicle cel.lular (ploidies), aquesta és una tècnica d'ús rutinari als laboratoris clínics. La possibilitat d'utilitzar aquesta tècnica per tal de separar cèl.lules (sorting) segons les seves característiques és una opció reservada a l'àmbit de la investigació.