Introducción

La citometría de flujo es una metodología que permite obtener información sobre las características físicas y químicas de células o partículas en suspensión que atraviesan una fuente de luz (láser). Posee un amplio espectro de aplicaciones, que abarcan desde el diagnóstico clínico (principalmente en el ámbito de la Hematología oncológica y la Inmunología), hasta complejos proyectos de investigación en el campo de la biomedicina y de la biología celular en general.

Después de los primeros intentos sin éxito para realizar un contaje celular automatizado durante las primeras décadas del siglo XX, se intentó desarrollar durante los años 50 una tecnología que permitiera el estudio de bacterias durante la guerra fría para hacer frente a los peligros de armas bactereológicas. El perfeccionamiento de la cámara de flujo en la siguiente década permitió las primeras aplicaciones en citómetros de flujo experimentales, hasta que en la década de los 70 se empezó la producción en serie de las primeras unidades. Paralelamente, bajo idénticos principios, se desarrolló la tecnología de la separación celular por deflección electrostática, un híbrido entre un citómetro de flujo y una impresora de inyección de tinta. De éste último viene el acrónimo FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).

El desarrollo de los anticuerpos monoclonales en la década de los 80, junto con el perfeccionamiento de los citómetros de flujo, ha permitido el uso de la citometría de flujo en el diagnóstico clínico. Desde el estudio de subpoblaciones linfocitarias CD4+ para monitorizar el desarrollo del VIH, pasando por el diagnóstico de patologías hematológicas y estudios de ciclo celular (ploidías), ésta es una técnica de uso rutinario en laboratorios clínicos. La posibilidad de utilizar esta tecnología para separar células (cell sorting) es una opción reservada generalmente al ámbito de la investigación.

Montaje realizado a partir de videos de BDBiociencias.
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Descripción

Un citómetro de flujo tiene tres sistemas principales:

Sistema hidráulico
Se compone de un conjunto de controles neumáticos y fluídicos necesarios para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo de forma estable e individualizada.

Sistema óptico
Consta de: láser, filtros, lentes.
La fuente de luz es producida normalmente por un o varios láser. En la mayoría de los citómetros se instala un láser de gas (comunmente argón) refrigerado por aire, que produce una luz monocromática de 488 nm como láser principal. Esta luz es utilizada para la excitación de la mayoría de los fluorocromos y provoca la dispersión de luz que nos informa de las características celulares. Las últimas tecnologías han desarrollado láser de estado sólido que están reemplazando a los láser de gas por su menor consumo y mayor durabilidad. La presencia de varios láser acompañando al primario nos permitirá ampliar el abanico de lectura de fluorocromos, desde el violeta hasta el rojo lejano. La luz dispersada y la fluorescencia será recogida por un sistema de filtros y espejos que dirigirán las señales a los sensores (fotodiodo/fotomultiplicadores).

Sistema electrónico-informático
Los fotomultiplicadores convierten la luz dispersa (fotones) en señales eléctricas (voltaje). Estas señales analógicas, después de varios procesos de amplificación y conversión, serán digitalizadas para visualizarlos en el ordenador. Existen actualmente nuevos sistemas de conversión a valores digitales que permiten modificar valores de compensación de señales fluorescentes y escalas lin-log posteriormente a la adquisición de datos.

La perfecta integración de estos sistemas permite un rápido y preciso análisis de un elevado número de células en poco tiempo.

Proceso

La suspensión celular es preparada previamente con anticuerpos monoclonales conjugados con diferentes fluorocromos (FITC, PE, PerCP, PECy5, APC, etc.) o sondas fluorescentes (PI, DHR, DiOC,...) y es introducida en el sistema hidráulico de manera que las células atraviesen individualmente la cámara de flujo, donde el haz del laser intercepta las células. El contacto del haz del láser con una célula produce dos tipos diferentes de dispersión: frontal y lateral (90º). La dispersión frontal (Forward Scatter) nos da información acerca del tamaño celular, mientras que la dispersión lateral (Side Scatter) nos informa de la complejidad celular. Los fluorocromos de los anticuerpos monoclonales o sondas presentes en la membrana o el interior celular son a la vez excitados por la luz del láser y generan fluorescencias que son recogidas por el sistema óptico para su posterior procesamiento y digitalización.

Aplicaciones

Detección de subpoblaciones celulares (inmunofenotipado)
Apoptosis
Ciclo celular
Viabilidad
Ensayos funcionales (metabolismo oxidativo, proliferación, calcio intracelular, pH,...)
Separación celular
Ensayos multiplexados (Beads Arrays)